多肽是由多個(gè)氨基酸通過酰胺鍵(肽鍵)連接而成的生物分子，是蛋白質(zhì)的基本組成單元，也是眾多藥物、激素、抗菌劑和信號(hào)分子的核心結(jié)構(gòu)。隨著生物醫(yī)藥、新材料和化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展，人工合成多肽已成為科研與工業(yè)領(lǐng)域的重要技術(shù)。本文將系統(tǒng)介紹多肽合成的基本原理、主流方法、關(guān)鍵步驟及其應(yīng)用。

一、什么是多肽合成?

多肽合成是指在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)條件下，按照預(yù)設(shè)的氨基酸序列，通過化學(xué)方法將氨基酸逐個(gè)連接，形成特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過程。根據(jù)反應(yīng)體系的不同，可分為液相合成和固相合成。其中，固相多肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS)由美國(guó)化學(xué)家R. Bruce Merrifield于1963年研究的，并因此獲得1984年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，現(xiàn)已成為主流技術(shù)。

二、固相多肽合成的基本原理

SPPS的核心思想是：將多肽鏈的C端(羧基端)共價(jià)連接到不溶性高分子樹脂上，然后從N端(氨基端)開始，逐個(gè)添加氨基酸，每加一個(gè)氨基酸就完成一次“脫保護(hù)—偶聯(lián)—洗滌”的循環(huán)。整個(gè)過程在固相載體上進(jìn)行，未反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)物可通過簡(jiǎn)單過濾和洗滌去除，極大簡(jiǎn)化了純化步驟。

三、多肽合成的關(guān)鍵步驟

1. 樹脂選擇與首氨基酸固定

合成起始于選擇合適的固相載體(如交聯(lián)聚苯乙烯、PEG-PS樹脂等)，其表面帶有可反應(yīng)的官能團(tuán)(如Wang樹脂的羥基、Rink Amide樹脂的氨基)。第一個(gè)氨基酸的羧基與樹脂通過酯鍵或酰胺鍵連接，其α-氨基需預(yù)先保護(hù)。

2. 氨基酸的保護(hù)與脫保護(hù)

為防止副反應(yīng)，參與反應(yīng)的氨基酸必須進(jìn)行選擇性保護(hù)：

α-氨基：常用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)保護(hù);

側(cè)鏈活性基團(tuán)(如Lys的ε-氨基、Cys的巰基、Asp/Glu的羧基等)：采用酸敏感的保護(hù)基(如tBu、Trt等);

羧基：在固相合成中通常不保護(hù)，因其已用于偶聯(lián)。

每輪偶聯(lián)前，需先脫除當(dāng)前樹脂上多肽鏈N端的保護(hù)基，暴露出游離氨基以進(jìn)行下一步反應(yīng)。

3. 成肽反應(yīng)(偶聯(lián))

將下一個(gè)保護(hù)氨基酸的羧基活化(常用HBTU/HOBt/DIPEA、PyBOP、DIC/Oxyma等縮合體系)，與樹脂上多肽的游離氨基反應(yīng)，形成新的肽鍵。反應(yīng)需高效、快速，避免消旋或副產(chǎn)物生成。

4. 裂解與脫側(cè)鏈保護(hù)

當(dāng)目標(biāo)序列合成完成后，需用強(qiáng)酸試劑(如TFA)將多肽從樹脂上切割下來，同時(shí)脫除所有側(cè)鏈保護(hù)基。Fmoc策略常用TFA/水/清除劑(如TIS)混合液;Boc策略則需更劇烈的條件(如HF或TFMSA)。

5. 純化與鑒定

裂解得到的粗品多肽含有缺失序列、副產(chǎn)物和雜質(zhì)，需通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化。隨后利用質(zhì)譜(MS)確認(rèn)分子量，分析型HPLC評(píng)估純度，必要時(shí)進(jìn)行氨基酸組成分析或圓二色譜(CD)結(jié)構(gòu)表征。

四、兩種主流合成策略：Fmoc vs Boc

目前，F(xiàn)moc/tBu策略因操作安全、條件溫和、兼容性強(qiáng)，已成為絕大多數(shù)多肽合成的理想選擇。

五、多肽合成的應(yīng)用

藥物開發(fā)：如胰島素類似物、GLP-1受體激動(dòng)劑(司美格魯肽)、抗菌肽等;

疫苗研發(fā)：合成抗原表位肽用于免疫研究;

基礎(chǔ)科研：制備標(biāo)記肽、酶底物、受體配體等;

化妝品與保健品：如信號(hào)肽(促進(jìn)膠原蛋白生成)、谷胱甘肽等;

材料科學(xué)：自組裝多肽納米材料、生物傳感器等。

六、挑戰(zhàn)與未來方向

盡管多肽合成技術(shù)已相當(dāng)成熟，但仍面臨長(zhǎng)肽合成效率低、消旋風(fēng)險(xiǎn)、疏水肽聚集難溶等挑戰(zhàn)。當(dāng)前研究熱點(diǎn)包括：

自動(dòng)化與高通量合成平臺(tái);

微波輔助加速偶聯(lián);

化學(xué)連接法(Native Chemical Ligation)合成超長(zhǎng)肽或蛋白質(zhì);

綠色溶劑替代DMF;

人工智能輔助序列設(shè)計(jì)與合成優(yōu)化。

多肽合成是一項(xiàng)融合有機(jī)化學(xué)、高分子科學(xué)與生物技術(shù)的精密工程。從 Merrifield 的開創(chuàng)性工作到今天的自動(dòng)化合成平臺(tái)，這項(xiàng)技術(shù)不僅推動(dòng)了生命科學(xué)的發(fā)展，更在醫(yī)藥健康領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。